Originalartikel von DIMA Biotechnology
Membranproteine (MP) sind die Torwächter der Zellen und spielen eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl von Zellfunktionen wie Stofftransport, Signalübertragung und Zell-zu-Zell-Erkennung. Abnormale Funktionen von MP führen häufig zum Auftreten von Krankheiten. Daher machen MP mehr als 60% aller derzeit von der FDA zugelassenen Zielmoleküle und 90% der Zielmoleküle für Antikörper aus.
Trotz ihrer Bedeutung ist die Herstellung funktioneller Proteine für die Entdeckung von Arzneimitteln insbesondere bei Multi-Transmembranproteinen eine Herausforderung. Membranproteine neigen dazu, ihre Funktionen zu verlieren, wenn sie aus der Membran entfernt werden und das Expressionsniveau von Membranproteinen ist in den Wirtszellen in der Regel niedrig. Die zelluläre Expression rekombinanter Membranproteine führt aufgrund der hydrophoben Natur der Transmembransegmente häufig zu Proteinaggregation und Fehlfaltung. Aus diesem Grund werden Membranproteine in der pharmazeutischen Industrie oft als „undruggable“ Ziele betrachtet.
Unser Partner DIMA Biotechnology steht für Innovationen in der Entdeckung therapeutischer Antikörper und der Expression funktioneller Proteine. DIMA ist spezialisiert auf präklinische Forschungs- und Entwicklungslösungen für die Biopharma-Industrie. Das umfangreiche Portfolio umfasst mehr als 1.200 Antikörper und über 1.500 Proteine und Zytokine. Dazu gehören auch die DiMPro™-Transmembranproteine in voller Länge, die in Säugetier-Expressionssystemen als lösliche Proteinprodukte mit nativer Konformation und Aktivität hergestellt werden. In diesem Blogartikel erfahren Sie mehr über die verschiedenen Plattformen, die DIMA zur Herstellung von humanen Multi-Transmembranproteinen in voller Länge entwickelt hat.
1) DIMA-Plattformen zur Produktion von humanen Multi-Transmembranproteinen
6) Detergens-Solubilisierung von Membranproteinen
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Eine der wichtigsten Voraussetzungen für die Entwicklung von Antikörpern ist die Verwendung von Protein-Immunogenen, die den nativen Zustand des Zielproteins am besten imitieren. Die meisten Zielproteine, die sich für eine antikörperbasierte Therapie eignen, sind Membranproteine, die bekanntermaßen schwer zu exprimieren sind. Bislang wurden verschiedene Antigentypen für die Herstellung von mAbs gegen MP verwendet. Jeder dieser Typen hat seine eigenen Vor- und Nachteile (Tab. 1).
Extrazelluläre Domänen (ECDs) lassen sich leicht in hoher Expression aufreinigen. Sie haben jedoch normalerweise nicht die native Konformation der Zielproteine, was zum Verlust von Proteinaktivitäten und einigen Konformationsepitopen führen kann. Die Immunisierung ganzer Zellen wird häufig für die Herstellung von mAb gegen Transmembranproteine verwendet. Sie bewahrt die native Konformation und die Modifikationen der Zielproteine, hat eine hohe Immunogenität und erfordert keine komplexen Reinigungsschritte. Allerdings entstehen bei der Immunisierung ganzer Zellen häufig viele unspezifische Antikörper gegen andere Proteine, insbesondere gegen die reichlich vorhandenen zytoplasmatischen Proteine.
| Antigentyp | Vorteile | Nachteile |
| Extrazelluläre Domäne |
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Aufgereinigtes Protein hat möglicherweise keine native Konformation, was zum Verlust einiger Konformationsepitope führen kann |
| Immunisierung ganzer Zellen |
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Bildung von unspezifischen Antikörpern gegen andere Proteine, v.a. zytoplasmatische Proteine |
| Volllängen-Membranprotein |
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Aufgrund der hydrophoben Eigenschaften ist es schwierig, die native Konformation in Form von löslichen Proteinen zu erhalten |
Um diese Probleme zu lösen, hat DIMA Biotech fünf Plattformen für die Produktion von humanen Multi-Transmembranproteinen in voller Länge entwickelt, darunter Nanodiscs, Virus-ähnliche Partikel (VLP), Membran-Nanopartikel (MNP) und Exosome (EXO) (Abb. 1). Alle Plattformen basieren auf Säugetier-Expressionssystemen (HEK293) und stellen Membranproteine als lösliche Proteinprodukte mit nativer Konformation und Aktivität sowie mit authentischen posttranslationalen Modifikationen her. Die Verwendung von serumfreiem Medium minimiert darüber hinaus das Risiko der Kontamination von Wirtszellen. Die hergestellten Proteine können für die Entwicklung hochspezifischer Therapien eingesetzt werden, die auf bisher unzugängliche Ziele wie Ionenkanäle und Transporter abzielen. Zu den Schlüsselapplikationen der Proteine zählen:
Abbildung 1: DIMAs Lösungen für die Multi-Transmembranproteine in voller Länge.
Um die beste Produktionsstrategie zu finden, untersucht und entwirft DIMA für jedes Zielmembranprotein ein eigenes Expressionskonstrukt. Während sie für MP mit nur einer Transmembran-Domäne die gut konzipierte ECD-Fraktion verwenden, um die funktionelle Domäne zu imitieren, nutzt DIMA für Multi-Transmembranproteine in voller Länge, wie z. B. GPCR- und Claudin-Proteine, eine der fünf selbst entwickelten Plattformen. Diese zeichnen sich durch neue Expressions- und Extraktionstechnologien aus und können in zwei Kategorien eingeteilt werden:
Virusähnliche Partikel (VLP) sind selbstorganisierende Multiprotein-Nanopartikel mit einer ähnlichen strukturellen Organisation und Konformation wie Viren, jedoch ohne virales Genom. Die Größe der VLP beträgt etwa 100-150 nm. Sie werden von der Oberfläche von Zellen, welche die Zielmembranproteine exprimieren, sezerniert. Die gereinigten VLP haben die Ziel-MP in eine vollständige Phospholipid-Membranstruktur eingebaut, die den natürlichen membrandurchdringenden Zustand des Proteins nachahmt.
VLP können für biochemische Routineanalysen verwendet werden, einschließlich ELISA, SPR-Affinitätsanalysen, Phage-Display-Screenings, Proteinmarkierungs- und Zellbindungsexperimente oder Flow-Virometrie-Analysen. Sie können auch als funktionelle Proteinantigene verwendet werden, um aktive Antikörper mit hohem Wirkstoffpotenzial zu entwickeln, da das Zielprotein im VLP einen Zustand aufweist, der seinem nativen Zustand auf der Zelloberfläche entspricht.
| Vorteile | Limitationen | Anwendungen |
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Im Gegensatz zu anderen auf dem Markt befindlichen Membrangerüstprotein (MSP)-Nanodiscs können die von DIMA Biotech entwickelten synthetischen Nanodiscs direkt aus den Zellen hergestellt werden. Die bei diesem Prozess verwendeten Polymere haben eine Doppelfunktion. Sie lösen die Zellmembranen auf, wie das Detergens, und nutzen zelluläre Phospholipide, um Nanodiscs um die Membranproteine herum zu bilden. Die in das Zielprotein eingebetteten Nanodiscs können dann gereinigt werden.
| Vorteile | Limitationen | Anwendungen |
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Mit Plasmamembranen beschichtete Nanopartikel (MNP) wurden bereits für verschiedene Anwendungen eingesetzt, u. a. für die Verabreichung von Therapeutika und die Auslösung von Immunreaktionen. Im Gegensatz zu herkömmlichen Strategien nutzen MNP direkt die intakten und natürlichen Funktionen von Zellmembranen und zeichnen sich durch hohe Biokompatibilität, Spezifität und geringe Nebenwirkungen aus. DIMA Biotech hat eine optimierte MNP-Plattform für die Produktion von Volllängen-Membranproteinen entwickelt, die die Membranbeschichtungstechnologie und die HEK293-basierte Expressionsplattform nutzt. Die hochreinen, mit Plasmamembranen beschichteten Nanopartikel wurden durch Extrusion nach Membranextraktion aus den HEK293-Wirtszellen, die die überexprimierten Zielproteine enthalten, hergestellt.
| Vorteile | Limitationen | Anwendungen |
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Exosomen (EXO) sind sekretierte Membran-Nanopartikel, die durch die Fusion von multivesikulären Körpern mit der Plasmamembran entstehen. Die Größe von Exosomen beträgt etwa 30-150 nm. Exosomen können aus in vitro-Zellkulturen gereinigt werden. Wie VLP weisen auch EXO eine hervorragende Immunogenität auf und haben eine Membranstruktur, die der der nativen Plasmamembran nahe kommt. Überexprimierte Membranproteine werden in die Wirtszellmembran eingefügt und als Exosome ausgeschieden, die gereinigt und für eine Reihe von nachgeschalteten Studien verwendet werden können. Im Gegensatz zu VLP haben die gereinigten EXO eine minimale Zytotoxizität. Allerdings können nicht alle MP in EXO aufgenommen und ins Medium sezerniert werden.
| Vorteile | Limitationen | Anwendungen |
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Detergenzien sind amphipathische Moleküle mit hydrophilen polaren Köpfen und unpolaren hydrophoben Schwänzen. Bei einer bestimmten Konzentration können Detergenzien stabile Mizellen mit hydrophoben Kernen bilden, die zur Isolierung der aktiven Membranproteine in löslichen Protein-Detergenz-Komplexen verwendet werden können. Die Abbildung zeigt, wie Detergenzien verwendet werden können, um Multi-Transmembranproteine in voller Länge zu isolieren und die hydrophobe Transmembranstruktur der Membranproteine zu erhalten.
| Vorteile | Limitationen | Anwendungen |
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